I. Pendahuluan
Karena banyaknya kematian masal pada ikan mas dan koi yang diduga karena disebabkan oleh serangan virus maka dilakukan penelitian ini. Untuk menanggulangi terhadap koi herpes virus (KHP) maka akan dilakukan pencegahan seperti pengurangan stress. Untuk mengetahui adanya KHV bisa dilakukan dengan teknik PCR, namun DNA genom harus diisolasi dulu. Dengan berbagai macam metode yang digunakan diharapkan menemukan metoe yang terbaik dalam mendeteksi KHV demi mengurangi penyebaran virus itu.
II. Metode penelitian
Penelitian ini telah dilakukan di Laboratorium Bioteknologi Perikanan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan Universitas Padjadjaran. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui efektifitas dalam memperoleh konsentrasi dan kemurnian DNA serta efisiensi waktu pengerjaan dari metode isolasi DNA dengan membandingkan beberapa metode isolasi DNA diantaranya
- ektraksi DNA dengan Kit (Promega), teruji hasilnya, namun dana yang tinggi
- CTAB dengan phenol, memiliki waktu yang singkat
- modifikasi CTAB, konsentrasi DNA lebih tinggi, namun waktu yang cukup lama
- ekstraksi DNA dengan thermal lysis, cepat namun tidak melibatkan presipitasi dan pencucuian DNA, namun hanya ekstraksi saja.
Parameter yang digunakan adalah nilai kemurnian dan kualitas DNA hasil isolasi yang diperoleh dari analisis spektrofotometri dan analisis elektroforesis serta efisiensi waktu pengerjaan. Sampel yang digunakan adalah jaringan insang dan sirip ikan mas. Konsentrasi DNA dan kemurniannya diukur dengan metode spektrofotometri, sedangkan untuk visualisasi DNA hasil isolasi menggunakan metode elektroforesis serta pengujian keberadaan KHV dideteksi dengan bantuan PCR dengan menggunakan Primer pendeteksi KHV. Penelitian ini menggunakan metode survei dengan analisis deskriptif kualitatif.
III. Hasil penelitian
Dari hasil isolasi DNA memungkinkan hasil isolat DNA yang berbeda, hal ini terbagntung pada efektifitas metode dalam menghasilkan isolat DNA yang baik dari kualitas maupun kuantitas serta tingkat ketelitian cara pengerjaan. Penggunaan jaringan insang sebagai obyek karena merupakan organ target dari KHV. Sirip merupakan organ yang langsung kontak dengan lingkungan sekitarnya.
Hasil kuantifikasi dengan menghitung konsentrasi dan tingkat kemurnian meenggunkana alat spektrofotometer
Kemurnian DNA dapat dilihat dari rasio absorbansi DNA (A260 : A280). Dimana nilai rata- rata kemurnian (r) DNA yang diperoleh dari hasil penelitian ini berkisar antara 1,7 – 2,1. menurut Sambrook dkk. Hasil isolasi dikatakan murni jika rasio (A260 : A280) antara 1,8 hingga 2,0 .
secara umum menunjukkan bahwa metode modifikasi CTAB memberikan hasil isolasi DNA dengan konsentrasi yang tertinggi yaitu 70,10 μg/ml . Namun waktu yang dibutuhkan untuk pengerjaannya cukup lama. Metode isolasi CTAB dengan phenol merupakan metode yang menggunakan CTAB sebagai buffer lisis yang berperan untuk memecah membran sel inang untuk mengeluarkan DNA genom. Pemurnian menggunakan Phenol : kloroform : isoamil alkohol.
Hasil isolasi DNA menggunakan promega mampu menghasilkan isolat DNA genom yang berukuran besar dan berkualitas baik.namunmsih ada materi ikutan.
Metode modifikasi CTAB mampu mengisolasi DNA genom ikan mas dengan kualitas baik yang ditunjukan pada hasil elektroforesis (gambar 1c) namun materi ikutan lain masih terbawa.
Metode ekstraksi DNA dengan thermal lysis memiliki waktu pengerjaan yang singkat. Metode ini dengan menggunakan suhu panas pada proses pemecahan selnya. Penggunaan suhu tinggi untuk memaksimalkan pemecahan selnya (99 derajat celsius) dengan waktu 2 menit suapaya DNA tidak rusak. Namun konsentrasi DNA yang diperoleh cukup rendah yaitu 9,25 μg/ml dengan nilai kemurnian berkisar antara 1,6-1,8.
Pengujian dengat teknik PCR.
Nilai konsentrasi relatif tinggi 71,05 ug/ml sehingga perlu diencerkan sampai berkisar 5 ug/ml supaya bisa digunakan di PCR. Diamplifikasi dan di elektroforesis menggunakan gel agarose 1%
Perbandingan metode isolasi DNA terhadap sensifitas deteksi dini KHV
IV. Kesimpulan
Metode yang paling sensitif dalam mengisolasi DNA genom ikan mas yang terinfeksi KHV adalah metode CTAB. Karena memnghasilkan kemurnaian DNA yang baik dengan konsentrasi DNA tertinggi. Namun kurang efisien dalam waktu dan cara pengerjaannya.
Metode yang paling efisien waktu adalam thermal lysis dengn lama pengerjaan sekitar 2 jam pengerjaan dan mudah.
Jurnal Akuatika Vol 2, No 1 (2011) dapat diakses melalui http://jurnal.unpad.ac.id/index.php/akuatika/article/view/507
